Gruppe Joussen - Angiogeneseforschung

Vasodilatation eröffnet die Angiogenese und erfolgt hauptsächlich als Antwort auf NO (Stickoxid). NO kann VEGF hochregulieren, welches seinerseits die Gefäßpermeabilität steigert (VEGF = VPF, vascular permeability factor), und zwar durch Reorganisation von Adhäsionsmolekülen wie PCAM-1 oder VE-Cadherin.

Angiopoietin-1 (Ang-1), ein Ligand des Endothelzellrezeptors Tie-2, ist ein natürlich vorkommender Anti-Permeabilitätsfaktor. Ein anderes Mitglied der Angiopoietin-Familie – Angiopoietin-2 (Ang-2), ein Inhibitor der Tie-2 Signaltransduktion und natürlicher Antagonist von Angiopoietin-1, verstärkt das Aussprossen von Endothelzellen. Ang-2 trägt dazu bei, glatte Muskelzellen von Endothelzellen abzulösen und die extrazelluläre Matrix aufzulösen. Dadurch wird die Migration von Endothelzellen angeregt.

Die Auflösung der extrazellulären Matrix erfordert Proteinasen, die nicht nur den "Platz" für die proliferierenden Endothelzellen schaffen, sondern auch die Freisetzung von Wachstumsfaktoren wie VEGF, bFGF, und IGF-1 ermöglichen. Derzeit sind über 20 Matrixmetalloproteinasen (MMPs) bekannt, die Einfluss auf die Angiogenese und Zellproliferation haben. Natürliche Antagonisten der Matrixmetalloproteinasen sind die gewebsständigen Inhibitoren (TIMPs). Durch Freisetzung von MMP-2, MMP-3 und MMP-9 und gleichzeitig durch Hemmung von TIMP-2 kann Ang-1 auch ein Aussprossen von Endothelzellen initiieren.

Wenn die physikalischen Barrieren durch die Auflösung der extrazellulären Matrix aufgelöst werden, können sich die Endothelzellen aus dem Verband lösen. Es setzt eine komplexe Interaktion zwischen Wachstumsfaktoren (VEGF, FGFs, HGF, u.a.), Differenzierungsfaktoren (z.B. den Angiopoeitinen) und den zugehörigen Rezeptoren ein.

Am besten untersucht sind die Auswirkungen von VEGF und bFGF, jedoch könnte auch anderen Wachstumsfaktoren, von denen weniger bekannt ist, eine wichtigere Rolle zukommen als bisher angenommen.

Verschiedene Stoffwechselwege können ein und denselben Angiogeneseschritt mehrfach stimulieren. Angiopoietin-1 bewirkt über den Rezeptor Tie-2 ein Aussprossen von Endothelzellen. Ang-2 kann in der Kombination mit VEGF ebenfalls das Aussprossen von Endothelzellen induzieren, führt aber in Abwesenheit von VEGF zu einer Gefäßregression. PDGF wirkt angiogen auf aussprossende Endothelzellen und rekrutiert Perizyten um wachsende Gefäßsprosse. eNOS (endotheliale Stickstoffoxidsynthase) hat ebenfalls angiogene Eigenschaften und wird durch VEGF aktiviert. Verschiedene Mitglieder der TGF-ß Familie wie Activin A und TNFalpha stimulieren oder inhibieren das Wachstum von Endothelzellen in verschiedenen Modellen. Auch einige Chemokine, unter anderem MCP-1, induzieren Endothelzellwachstum.

Endothelzellen, die in die Matrix einwachsen, bilden solide Stränge, die nachfolgend ein Lumen bilden. Dies wird durch eine Interkalation und eine Verdünnung der Endothelzellen erreicht, zusammen mit einer Fusion mit existierenden Gefäßen, um letztlich ein längeres Gefäß zu bilden. Die Sonderform des intussuskeptiven Wachstums wird separat diskutiert.

Der Durchmesser des Gefäßlumens ist durch eine Reihe von Faktoren reguliert. VEGF121 und VEGF165 ihre Rezeptoren beispielsweise vergrößern das Gefäßlumen, wohingegen VEGF189 den Gefäßdurchmesser verringert. Ang-1 vergrößert in Kombination mit VEGF ebenfalls den Gefäßdurchmesser. Darüber hinaus sind verschiedene Integrine (alpah5ß1 und alpha5ß3) involviert, deren Funktion über RGD Peptide unterbunden werden kann, was bereits verschiedentlich therapeutisch genutzt wurden. Thrombospondin-1 (TSP-1) kann als endogener Inhibitor der Lumenbildung angesehen werden.

Das intussuskeptive Gefäßwachstum beschreibt die Bildung eines Gefäßnetzwerks aus einem mit Endothelzellen ausgekleideten Gefäß durch Spaltung eines Gefäßes oder Einsetzen von Gewebssprossen. Dieses Gefäßwachstum resultiert in einem komplexen Gefäßnetzwerk und entsteht über einen nicht-sprossenden also im eigentlichen Sinne nicht angiogenen Mechanismus (4). Gerade in jüngster Zeit wurde dieser Form des Gefäßwachstums wieder mehr Bedeutung für die Ausbildung von Tumorgefäßen, aber auch im Hinblick auf die Bildung retinaler Gefäße, beigemessen. Derzeit wird angenommen, daß das Tie-2 – Angiopoietin – System für intussuskeptives Gefäßwachstum mitverantwortlich ist. Die molekularen und morphologischen Grundlagen müssen noch genauer untersucht werden.

Sobald ein neues Gefäßsystem etabliert ist, werden die Endothelzellen gegenüber exogenen Faktoren resistent. In diesem Zustand können sie eine Überlebensdauer von mehreren Jahren haben. Verkürzung der Lebensdauer der Endothelzellen bewirkt eine Gefäßregression, die im adulten Organismus beispielsweise in der Retina oder im Ovar bekannt ist.

Apoptose, d.h. ein programmierter Zelltod, kann bei Endothelzellen durch eine Reihe von Faktoren induziert werden. Eine pathologisch erhöhte Apoptose von Endothelzellen und die daraus folgende Gefäßleckage kann bei der diabetischen Retinopathie beobachtet werden. Die Inhibition der Apoptose reduziert im experimentellen Modell die diabetische Gefäßleckage, siehe auch Zusammenfassung diabetische Retinopathie).

VEGF scheint als "Survivalfactor" zu wirken. Hierbei ist VEGF von der Interaktion mit VEGFR-2, PI-3 Kinase und VE-Cadherin abhängig. Fehlt die zytoplasmatische Domäne von VE-Cadherin, kommt es zur Apoptose von Endothelzellen durch die Verhinderung der VEGF vermittelten Signaltransduktion über Akt-Kinase. Andere Faktoren, die für ein Überleben von Endothelzellen verantwortlich sind, sind wiederum die Angiopoietine über ihre Rezeptoren Tie-1 und Tie-2. Im Gegensatz zu seinem Gegenspieler Ang-2, hat Ang-1 eine Überlebensfunktion, die zumindest teilweise über anti-apoptotische Gene wie Survivin vermittelt wird. Daneben sind verschiedene Moleküle, die den Zellzyklus und die Apoptose regulieren, wie p53, p21, p16 sowie Bax und p42/44 MAPKinase, involviert.

Die Gefäßintegrität hängt in verschiedenen Gefäßbetten auch von hämodynamischen Scherkräften ab, über die nicht nur die metabolischen Erfordernisse für das Zielgewebe bereitgestellt werden, sondern auch der Endothelzell-turnover reguliert wird.

Das Gefäßendothelium muß unterschiedlichen lokalen physiologischen Anforderungen genügen. Beispielsweise benötigt die Blut-Hirnschranke oder auch die Blut-Retina Schranke verschiedene Strukturen, die die Gefäße quasi abdichten. Diese sogenannten Tight-junctions werden aus Membran- und zytosolischen Proteinen gebildet, die zur Gruppe der Cadherine, Occludine, Claudine und anderen gehören. In anderen Gefäßgebieten ist das Endothel hingegen fenestriert und besitzt keine Tight-junctions. Insgesamt sind die Faktoren, die die Ausprägung dieser unterschiedlichen Endotheleigenschaften regulieren, noch weitgehend unbekannt.

Wenn ein Gefäß auf einen angiogenen Stimulus hin wächst, kann es sich durch Intussuskeption (siehe oben) spalten. Das Einwachsen von peri-endothelialen Zellen und die nachfolgende Stabilisation der Gefäßabschnitte führen dann zu einer Neuorganisation des Gefäßnetzes. VEGF fördert neben dem Aussprossen (sprouting) von Gefäßen auch ihre Teilung (splitting). Hierzu scheint insbesondere die VEGF120 Isoform wichtig zu sein. Ihr Fehlen bewirkt eine reduzierte Verästelung von Gefäßen. Angiopoietin-1 verhindert ebenfalls die Verzweigung von Gefäßen.

Die Induktion von Gefäßverzweigungen scheint auch von lokalen Gegebenheiten abhängig zu sein. Zwei Besipiele hierfür sind Renin, welches in Gefäßen der Niere für die Verzweigung verantwortlich ist, sowie aFGF, das in myokardialen Gefäßen eine Rolle spielt.

Die Voraussetzungen zur Differenzierung in Arteriolen, Venolen und Kapillaren sind noch nicht hinreichend verstanden. Arterien wie Venen entstehen gleichermaßen aus Angioblasten. Die Signaltransduktion schient vorwiegend über Notch reguliert zu werden. Die große Familie der Ephrine spielt aber offenbar ebenfalls eine Rolle. Ephrine sind Liganden für ihre korrespondierenden Ephrin-Rezeptoren (Eph). Ephrin A1 und Ephrin A2 sind angiogen, die Ephrine B1 und B2 induzieren ein Aussprossen von Gefäßen. Ephrin B2 scheint ausschließlich auf Arterien vorzukommen, während sein Rezeptor (EphB4) nur auf Venen gefunden wird. Wird das Ephrin B2-Gen bei Mäusen ausgeschaltet, so resultiert zwar eine normale Vaskulogenese, jedoch eine defiziente Angiogenese, bei der sich nur lange schmale Schläuche, jedoch keine Arterien und Venen differenzieren.

Peri-endotheliale Zellen wirken stabilisierend durch Verhinderung der endothelialen Proliferation und Migration. Ohne die peri-endothelialen Zellen, bestehen Gefäße nur in Anwesenheit eines angiogenen Stimulus fort. Periendothelzellen sind darüber hinaus metabolisch aktiv und exprimieren Wachstumsfaktoren, Zytokine und vasoaktive Peptide. Glatte Muskelzellen können sowohl aus Endothelzellen, wie aus mesenchymalen Zellen, aber auch aus Vorläuferzellen aus dem Knochenmark oder aus Makrophagen hergeleitet werden, ihr genauer Ursprung ist jedoch noch nicht abschließend geklärt. Kürzlich wurden Vorläuferzellen identifiziert, die sich nach Exposition mit VEGF zu Endothelzellen differenzieren, nach Exposition mit PDGF-BB aber zu glatten Muskelzellen entwickeln.

Peri-endotheliale Zellen lassen sich durch mehrere Faktoren rekrutieren. PDGF-BB wirkt als Chemotaxin für Perizyten. Ang-1 und Tie-2 festigen die Interaktion zwischen peri-endothelialen Zellen und Endothelzellen. Die TGF-ß Familie (TGF-ß1, TGF-ß Rezeptor 2, Endoglin und Smad5) fördert die Differenzierung glatter Muskelzellen. Tissue factor (TF) rekrutiert Perizyten, wahrscheinlich über Aktivierung der Gerinnungskaskade und Thrombinbildung.

Die extrazelluläre Matrix bildet nicht nur die solide Grundstruktur, durch die die Endothelzellen wandern können, sondern steuert auch verschiedene Wachstumsfaktoren bei. Beispielsweise ist das Integrin alpha5ß3, das die Bindung an Kollagen vermittelt, essentiell für das Überleben und die Ausreifung von Blutgefäßen während der Angiogenese. Anderen Matrixkomponenten wie Laminin, Vitronectin, Osteopontin, Fibrin und Thrombospondin werden ähnliche Eigenschaften zugeschrieben.

Bekanntlich reguliert Hypoxie die RNA-Expression des Wachstumsfaktors VEGF. Das gilt ebenso für weitere Genprodukte, die an der Regulation der Angiogenese beteiligt sind: VEGFR-1, VEGFR-2, Neuropilin-1, Neuropilin-2, Ang-2, NOS, TGF-ß1, PDGF-BB und IL-8. Ein Transkriptionskomplex gebildet aus Hypoxie-induzierten Faktoren (HIF) kann verschiedene Angiogenesegene aktivieren. Bei Normoxie wird HIF-1a schnell über VHL, ein Genprodukt, das für die Von-Hippel-Lindau Angiomatose verantwortlich ist, degradiert. Bei der diabetischen Retinopathie aktiviert HIF-1a die VEGF Expression.

Die Regulation angiogener Faktoren erfolgt über verschiedene intrazelluläre Signaltransduktionswege. Der PI-3 Kinase/Akt Komplex stabilisiert HIF-1a. MAP-Kinase aktiviert Erk-1/2 und darüber hinaus weitere Faktoren, die eine erhöhte Transkription des VEGF-Genes bewirken.

Pathologische Angiogenese zeichnet sich durch eine quantitativ fehlgesteuerte Gefäßbildung (verstärkte oder verringerte Anigogenese) sowie durch funktionell inadäquate Gefäße aus. Dabei liegt ein Ungleichgewicht von stimulatorischen und inhibitorischen Faktoren zugrunde. Beispiele für pathologische Angiogenese sind die diabetische Retinopathie, die Tumor-Neoangiogenese, sowie die verstärkte Angiogenese im Rahmen der Rheumatoiden Arthritis. Bei manchen Erkrankungen, so wie der Arteriosklerose, wäre eine Erhöhung der reaktiv einsetzenden Angiogenese wünschenswert. Bei anderen Erkrankungen, wie beim Diabetes ist das Krankheitsbild abhängig vom Umfeld gekennzeichnet durch einen Untergang von Gefäßen mit Ischämien oder Proliferationen. So ist bei der proliferativen diabetischen Retinopathie eine Hemmung der Neoangiogenese wünschenswert, während bei der Diabetes assoziierten koronaren Herzerkrankung eine Neoangiogenese gerade therapeutisch wünschenswert wäre.

Bei der Tumorangiogenese entstehen wirre, nicht ausreichend ausgereifte Gefäßnetzwerke, die in einer heterogenen Durchblutung des Tumorgewebes resultieren. Während an manchen Stellen durch die erhöhte Permeabilität Blutbestandteile vermehrt austreten, findet sich an anderen Stellen gar kein oder gar ein retrograder Blutfluss. Dies erschwert eine effiziente Applikation von antineoplastischen Medikamenten.

Beim uvealen Melanom des Auges wurde zuerst die mit "vascular mimicry" bezeichnete besondere Morphologie mancher Tumorgefäße beschrieben. Es handelt sich dabei um Blut-durchflossene Kanäle, in denen keine Endothelzellauskleidung nachgewiesen werden konnte. Zunächst heftig umstritten, wurde das Vorhandensein solcher Kanäle mehr und mehr akzeptiert, wobei sich später auch der Begriff der "Mosaikgefäße" durchsetzte (Gefäße, deren Auskleidung teilweise aus Endothelzellen und teilweise aus Tumorzellen besteht).

Die pathologische Angiogenese ist grundsätzlich durch ähnliche molekulare Mechanismen gesteuert, wie die oben beschriebene physiologische Angiogenese. Von großer Wichtigkeit sind die Charakteristika des umliegenden Gewebes und die Ursache der pathologischen Vaskularisation (z.B. Entzündungen der Hornhaut, Hypoxie bei der Retinopathia praematurorum).

Vor Beginn einer Behandlung muss festgelegt werden, welche Gefäße inhibiert werden sollen, und wie notwendige Versorgungsgefäße geschützt werden können. Bei chorioidalen Neovaskularisationen oder der diabetischen Makulopathie wäre es vielleicht ausreichend, lediglich gezielt die Leckage zu hemmen und eine Regression physiologischer Gefäße nicht zu riskieren. Auch bei der Therapie maligner Tumoren muss ausgeschlossen werden, dass normale Gefäße in Mitleidenschaft gezogen werden. Zahlreiche Angiogenese-Hemmer stehen zur Verfügung. Von den synthetischen und endogenen Inhibitoren, sind Angiostatin und Endostatin in der Tumorforschung recht ausführlich untersucht worden. In der Augenheilkunde ließ sich bislang kein erfolgversprechender Einsatz dieser Substanzen erkennen. Der Schlüssel zu einem wirksamen Ansatz scheint hier – wie anderswo – in der gezielten Verabreichung der Medikamente zu liegen, die nur auf die Zielzellen wirkt. Bei systemischer Applikation könnten in der Zukunft Biokonjugate eine Rolle spielen, bei denen durch Antikörper- oder Liganden-vermittelte Bindung eine Anreicherung im Zielgewebe erzielt werden kann (s.u.).

Die intravitreale Applikation von VEGF-Inhibitoren in den Glaskörper ist jedoch als großer Durchbruch in der Therapie der altersbedingten Makuladegeneration und anderer proliferativer Erkrankungen zu bezeichnen. Derzeit müssen wir (siehe auch klinische Patienteninformationen, zB zum Thema Avastin) jedoch noch in den Glaskörper hinein injizieren.

Für lokale Applikationen ist die Galenik von großer Bedeutung. Eine protrahierte Wirkstofffreisetzung wäre oft förderlich, da es sich um chronische Erkrankungen handelt. Erst die geeignete Kombination von Applikationsform und therapeutischem Agens werden den Fortschritt in der Therapie vasogen bedingter Erkrankungen vervollständigen.